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制限酵素処理後はセルフライゲーション*を防ぐために脱リン酸化処理をしますが、Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)を用いた場合、脱リン酸化とアルカリホスファターゼの不活化反応の時間を入れると約1.5時間要します。 私がやるなら、制限酵素処理→blunting→CIAP処理で、その間には特に精製のステップをいれず酵素や基質を加えていき、最後にゲルからの切り出しまたはPCI抽出ですね。 特にBAPによるニック部分の脱リン酸化処理は65℃、30分で行うのが望ましい 1)。 BAPの場合は必ず2回おこなう必要がある。 CIAPの場合は1回でもかまわない。
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CIAPでリン酸基をとれば、ライゲーションできません。 ベクターのリン酸基をとらないと、 ベクター自身がライゲーションしてしまいます（セルフライゲーションと言います）。 BAPは非常に安定性の高い酵素なので、反応終了後少なくとも2回フェノール処理を行なってください。 CIAPは、キレート剤存在下65℃、30分の熱処理で99%以上の活性が不可逆的に失活しますが、使用条件によっては不充分な場合もあるので、完全に失活させるためにはフェノール処理を行なってください。 一般に平滑末端や5'陥没末端は脱リン酸化の効率が悪くなります。 その場合は、BAPを用いた高温（55～60℃）での反応をおすすめします。 ベクターの調整方法としては、BglⅡとHindⅢで37℃、1時間30分でdouble digestionを行った後に、念のためCIAP処理（50μLの反応系にそのままCIAPを1μL加えてます）を37℃、30分行い、アガロースゲルで電気泳動をしてバンドを切り出しています。 インサートはBglⅡのみで37℃、1時間30分で処理し、同様にアガロースゲルで電気泳動をしてバンドを切り出しています。 ベクター＋インサートでライゲーションするとコロニーを多数認めるもののコロニーPCRをすると全く入っていません。 そこでベクターのみでライゲーションしてみると同様にコロニーが多数できてしまっています。
↓ ここからは常にon iceまたは4℃で作業する。 プラスチックのディスポのピペットを使用する。 ↓5-クロロ-8-ヒドロキシキノリンを0.5g加える。 ↓2層になるので上清をpH試験紙でチェック。
第1の方法では、CIAPはEDTA (5mM)、SDS (0.5%)、およびproteinase K (50ug/ml) (最終濃度)を加えることにより消化できます。 この消化は、56℃で30分間処理した後、70℃で10-15分間インキュベートすることで不活性化できます。 #2_Molecular Calf-Intestinal Alkaline Phosphatase（子ウシ腸管由来アルカリホスファターゼ）という酵素を用いて、DNAやRNA、タンパク質のリン酸基を除去する。 目的： ベクターDNAを制限酵素で切断した後、その末端にある5'末端のリン酸基を除去することでセルフライゲーションを防ぐ。 制限酵素処理の際にvector側にCIAPを一緒に加えればよい 組成. よって、BAP処理DNAサンプルをLigation反応に使用する場合には必ずフェノール処理などの精製が必要であることが示唆されました。 一方、CIAPは65℃、30分間の熱処理でほとんど失活させることができました。
